Rabu, 08 Februari 2017

IDENTIFIKASI FLAVONOID DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI ULTRA VIOLET DAN VISIBEL


Sejumlah review mengenai penggunaan spektrofotometri ultra violet dan visible dalam identifikasi falvonoid telah banyak dipublikasikan sejak tahun 1962. Sebuah buku yang ditulis oleh Mabry et al (1970) menampilkan sebuah katalog detail dari spektrum ultraviolet 175 senyawa flavonoid dan dilengkapi dengan data reagent yang menginduksi geseran pada masing-masing flavonoid. 


Pertimbangan Umum


Spektrofotometri UV menjadi teknik utama dalam analisis flavonoid karena 2 alasan berikut:
  1. Analisis hanya memerlukan sedikit senyawa murni. Seringkali bercak tunggal pada kromatografi kertas menghasilkan senyawa yang cukup untuk dianalisis dengan spektrofotometri UV.
  2. Jumlah informasi yang berhubungan dengan struktur senyawa meningkat jika digunakan bersama reagent spesifik yang beraksi dengan gugus fungsi tertentu pada flavonoid. Penambahan secara terpisah masing-masing reagent pada suatu sampel yang mengandung flavonoid dengan pelarut alkohol akan menghasilkan geseran spektrum UV yang signifikan. Geseran-geseran tipe ini biasanya diinduksi oleh penambahan natrium metoksida (NaOMe), natrium asetat (NaOAc), natrium asetat-asam borat (NaOAc/H3BO3), alumunium klorida (AlCl3) dan alumunium klorida/asam hidroklorida (AlCl3/HCl).
Spektrum UV flavonoid umumnya terdiri dari 2 puncak serapan maksimum, pada rentang panjang gelombang 240-285 nm (pita II) dan pada 300-400 nm (pita I). Pita II terbentuk dari cincin benzoil A, sedangkan pita I dihasilkan dari cincin cinnamoil B.

Spektrum Flavonoid dalam Metanol

FLAVON DAN FLAVONOL


Flavon mengabsorpsi pada daerah 304-350 nm, sedangkan flavonol pada 352-385 nm, sehingga serapan pada pita I ini memberi petunjuk awal tentang tipe flavonoid yang diuji. Flavon dan flavonol dengan banyak atom oksigen akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang dibanding dengan flavon dan flavonol yang memiliki atom oksigen lebih sedikit. Sebagai contoh:
  • Gallangin (3,5,7-triOH) puncak absorpsi pita I pada 359 nm
  • Kaemferol (3,5,7,4'-tetraOH), puncak pita I pada 367 nm
  • Quersetin (3,5,7,3',4'-pentaOH) puncak pita I pada 370 nm
  • Myristin (3,5,7,3',4',5'-hexaOH) puncak pita I pada 374 nm
Pita II kurang dipengaruhi oleh oksigenasi cincin B, meskipun 3',4'-dihydroxylated flavon umumnya menunjukan 2 puncak (atau satu puncak dengan bahu) pada daerah pita II. Pita II secara signifikan dipengaruhi oleh pola oksigenasi pada cincin A, dan panjang gelombang puncak meningkat dari 250 nm pada flavon menjadi 252 nm pada 7-hydroxyflavone, 268 nm pada 5-hydroxyflavone dan 5,7-dihydroxyflavone, 274 nm pada 5,6,7-trihydroxyflavone, serta 281 pada 5,7,8-trihydroxyflavone. Tak adanya gugus hidroksi pada kedua cincin biasanya dibuktikan dengan lemahnya intensitas pita yang relevan.

Metilasi atau glikosilasi pada atom 3,5- dan 4'-OH pada inti flavonoid menyebabkan geseran hipsokromik, khususnya pada pita I. Geseran tersebut sekitar 3-10 nm (pada pita I), menjadi 5-15 nm (pada pita I dan II) pada substitusi gugus 5-OH dan 12-17 nm pada substitusi 3-OH.


ISOFLAVON, FLAVANON, DAN DIHIDROFLAVONOL


Isoflavon, flavanon dan dihiroflavonol dikelompokkan manjadi satu karena kesamaan sifat dalam hal kurangnya konjugasi baik pada cincin A maupun B. Spektrum UV kelompok ini dapat dibedakan dari spektrum flavon dimana, intensitas absorpsi pita I lemah dan lebih menyerupai bahu bagi puncak pita II. Spektrum dari kelompok ini umumnya tidak dipengaruhi oleh pola oksigenasi dan substitusi pada cincin B. Namun, peningkatan oksigenasi pada cincin A menyebabkan geseran batokromik pada pita II, misal : 7,4'-dihydroxyisoflavone (249 nm), 5,7,4'-trihydroxyisoflavone (261 nm) dan 5,6,7,4'-tetrahydroxyisoflavone (270 nm).

Pada isoflavon, spektrum serapan pita II berada pada daerah 245-270 nm dan bahu pita I pada rentang 300-340 nm. 5-deoxyisoflavone (dan isoflavone 5-O-ethers) memiliki puncak pita II 7-17 nm lebih dekat dibanding 5-hydroxyisoflavone. Flavanon dan dihidroflavonol menunjukkan serapan maksimum pita II pada daerah 270-295 nm. Sebagai isoflavon, tidak adanya gugus 5-OH bebas menyebabkan geseran hipsokromik 10-15 nm.


KALKON DAN AURON


Kalkon dan auron dikarakterisasi oleh adanya spektrum pita I yang dominan dan pita II yang relatif minor. Pita II kalkon pada 220-270 nm sedangkan pita I pada 340-390 nm meski hanya sebuah pita minor atau infleksi sering terjadi pada daerah 300-320 nm. Sebagaimana flavonoid, peningkatan oksigenasi umumnya menyebabkan geseran batokromik terutama pada pita I.

Pita I auron umumnya ditemukan pada 370-430 nm. Contoh auron di alam: hispidol (388 nm), dan maritimetin (413 nm). Metilasi atau glikosilasi pada gugus OH pada inti auron tidak menyebabkan perubahan spektrum yang bermakna.


ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN


Spektrum antosianidin beserta glikosidanya, dan antosianin umumnya diukur dalam larutan metanol yang mengandung 0.01% HCl. Beberapa variasi lokasi serapan maksimum akan terjadi ketika pelarut yang digunakan etanol/HCl dan air/HCl yang saling menggantikan.

Antosianidin dan antosianin mempunyai serapan pita I pada rentang 465-550 nm, dan pita II menunjukkan puncak yang kurang intensif pada daerah 270-280 nm. Sebagaimana flavonoid laiinya, peningkatan oksigenasi pada cincin B menyebabkan geseran batokromik pita I, dibandingkan dengan pelargonidin (4'-OH) 520 nm, sianidin (3',4'-diOH) 553 nm, dan delphinidin (3',4',5'-triOH) 546 nm. Posisi pita I dapat juga menjadi panduan untuk menentukan substitusi pada cincin A, misalnya untuk membedakan 5,6,7-triOH antosianidin dari isomernya 5,7,8-triOH antosianidin , yang mengabsorpsi pada panjang gelombang 30 nm lebih pendek. 3-deoxyanthocyanidin memberikan puncak serapan pada pita I 40 nm lebih pendek dibanding 3-hydroxyanthocyanidin.

Metilasi dan glikosilasi pada gugus OH cincin A dan B antosianidin umumnya menyebabkan sedikit geseran hipsokromik. 3-glycosides dari pelargonidin, sianidin dan delphinidin masing-masing memiliki puncak pada 506, 525 dan 535 nm. Pola geseran batokromik dan intensitas absorpsi pada daerah 400-460 nm dapat digunakan untuk menentukan pola glikosilasi. Dimana Harborne menunjukkan bahwa 3,5-di- dan 5-glycoside hanya memiliki setengah absorpsi pada 440 nm,, yang relatif terhadap 3-glycosides.

Asilasi gula pada antosianin melalui substitusi  tipe asam sinamat ditunjukkan dengan adanya 2 puncak pada daerah UV, puncak tambahan (310-335 nm) disebabkan adanya gugus asil.


Geseran-geseran yang Diinduksi Natrium Metoksida


Semua gugus hidoksil (OH) dalam inti flavonoid akan terionisasi dalam beberapa tingkat tergantung pada kekuatan basa NaOMe. Karena pada umumnya flavonoid terhidroksilasi, geseran-geseran ke arah panjang gelombang yang lebih besar (batokromik) umumnya akan teramati pada kedua pita. Geseran-geseran yang terinduksi NaOMe diantaranya:
  1. Pada Flavon dan Flavonol
  • Adanya gugus 4'-OH dibuktikan dengan geseran batokromik pita I sebesar 40-65 nm, tanpa adanya penurunan intensitas
  • Adanya gugus 3-OH pada flavonol tanpa 4'-OH juga menghasilkan geseran batokromik 50-60 nm, namun dengan adanya penurunan intensitas
  • Glikosilasi pada gugus 7-OH sering terdeteksi dengan tidak adanya puncak absorpsi pada 320-330 nm yang umumnya akan teramati pada aglikon
  • Flavonol yang mengandung gugus OH pada nomor  3,4'- dan 3,3',4' , akan memberikan spektrum pada kedua pita dengan intensitas menurn seiring waktu 
   2. Pada Isoflavon, Flavanon dan dihidroflavonol
  • Tidak adanya geseran besar pada pita mengindikasikan tidak adanya hidroksilasi cincin A
  • Adanya sistem 5,6,7- dan 5,7,8-triOH dibuktikan dengan adanya degenerasi spektrum MeOH-NaOMe seiring waktu. Hal ini juga dapat menjadi indikasi adanya sistem 3',4'-diOH pada isflavon dan dan flavanon.
  •  Flavanon dan dihidroksiflavanol dengan sistem 5,7-diOH menunjukkan pergeseran batokromik yang konsisten sebesar 35-40 nm dalam NaOMe disertai dengan peningkatan intensitas puncak , Ketika gugus 5-OH tidak ada geseran sebesar 60 nm akan teramati.
  • Beberapa flavanon, khususnya yang tidak memeiliki gugus 5-OH bebas, berisomerisasi membentuk kalkon dalam larutan alkali kemudian akan teramati puncak pita I pada daerah 400 nm.
    3. Pada Kalkon dan Auron
  •  Gugus 4'-OH pada auron dan 4-OH pada kalkon dibuktikan dengan geseran batokromik sebesar 80-95 nm dan 60-100 nm, masing-masing, yang disertai dengan peningkatan intensitas
  • 6-OH auron memberikan geseran yang lebih kecil (sekitar 60-70 nm) dibandingkan 4'-OH auron. Dan jika terdapat 6,4'-diOH atau 6-OH-4'-alkoksi terdapat dalam senyawa maka geserannya akan lebih kecil lagi.
  • Kalkon yang tidak memiliki gugus 4-OH tapi memiliki 2- atau 4'-OH akan memberikan geseran batokromik pita I 60-100 nm, tanpa peningkatan intensitas
  • Geseran yang berhubungan dengan gugus 4'-OH pada kalkon dikurangi 40-50 nm ketika ada gugus 2'-OH atau 4-alkoksi..
    4. Antosianidin dan Antosianin
  •  Hanya antosianidin yang memberikan spektrum yang stabil dalam NaOMe, yaitu 3-deoxyanthocyanidins, geseran batokromik pita I sebesar 50-60 nm.

 Geseran-geseran yang Diinduksi Natium Asetat


Natrium asetat adalah basa yang lebih lemah dibandingkan NaOMe, karenanya hanya akan mengionisasi gugus OH fenolik yang lebih asam.
  1. Flavon dan Flavonol
  • Flavon dan flavonol yang mempunyai gugus 7-OH menunjukkan geseran batokromik 5-20 nm pada pita II. Adanya gugus 6- atau 8-oksigenais pada flavon (namun tidak pada flavonol) ditandai dengan penurunan tingkat geseran tersebut
  • Perbandingan pada geseran pita I spektrum NaOMe dan NaOAc pada 4'-OH flavon dan flavonol dapat menunjukan dimana gugus 7-OH tersubstitusi atau tidak. Ketika tersubstitusi, pada NaOAc akan menghasilkan geseran yang sama atau lebih besar dibandingkan NaOMe.
  • Adanya alkali mensensitisasi gugus seperti 5,5,7-, 5,7,8- dan 3,3',4'-triOH menyebabkan spektrum dalam NaOAc terdegenerasi seiring waktu 
    2.  Isoflavon, Flavanon dan Dihidroflavonol
  • Adanya gugus 7-OH pada isoflavon dibuktikan dengan adanya geseran batokromik sebesar 6-20 nm. Dalam 5,7-diOH flavanon dan dihidroflavonol geserannya sebesar 35 nm, sedangkan 5-deoksi flavanon dan dihidroflavonol geserannya sebesar 60 nm
  •  Alkali mensensitisasi gugus pada cincin A menyebabkan spektrum terdegenrasi seiring waktu.
   3. Kalkon dan Auron
  • Gugus OH pada posisi 4' dan atau 4 pada kalkon dan pada 4' dan atau 6 pada auron dibuktikan dengan geseran batokromik pada pita I atau dengan munculnya puncak bahu.

Geseran yang Diinduksi Borat


Campuran NaOAc dan asam borat digunakan untuk mendeteksi gugus o-OH pada semua jenis flavonoid, namun tidak pada antosianin dan antosianidin. Geseran batokromik yang teramati adalah sebagai berikut:

  1. Flavon dan flavonol (cincin B), 12-30 nm pada pita I. Gugus o-OH pada 6,7- dan 7,8- memberikan peningkatan ke arah geseran yang lebih rendah.
  2. Isoflavon, flavanon, dan dihidroflavonol (hanya cincin A) 10-15 nm (pita II). Geseran ini tidak teramati pada gugus 5,6-diOH. 
  3. Auron dan kalkon (cincin B) memberikan geseran 28-36 nm pada pita I. Gugus o-diOH memberikan peningkatan geseran yang lebih kecil.

Geseran yang Diinduksi Alumunium Klorida (AlCl3)


AlCl3 membentuk khelat dengan gugus fungsi seperti 5-hydroxy-4-keto, 3-hidroxy-4-keto dan ortho-hydroxy yang dibuktikan dengan adanya geseran batokromik pada salah satu atau kedua pita. 
  1. Stabilitas relatif kompleks yang terbentuk adalah sebagai berikut: flavonol > 5-OH (flavon) > 5-OH (flavanon) > o-OH > 3-OH dihidroksiflavonol
  2. Dengan adanya sejumlah kecil asam (HCl), kompleks akan terbentuk dengan gugus fungsi o-diOH dan 3-Hydroxy-4-keto dalam dekomposisi dihidroksiflavonol (gambar 1). Kompleks dihidroksiflavonol dapat dibedakan melalui instabilitasnya dalam NaOAc.
  3. Jejak air dalam etanol (tapi tidak dalam metanol) mencegah pembentukan kompleks Al-o-diOH, karena itu metanol menjadi pelarut pilihan utama dalam mendeteksi gugus o-diOH.
  4. Ketika sebuah gugus o-diOH ada dalam flavonoid bersamaan dengan 5- atau 3-OH, maka kompleks ganda akan terbentuk (gambar 1).
  5. Ketika dalam flavonoid terdapat gugus 3- atau 5-OH maka pembentukan khelat 3-hydroxy-4-keto lebih disukai.
FLAVON DAN FLAVONOL

  • Adanya gugus 5-OH dan tidak adanya 3-OH dibuktikan dengan geseran batokromik pita I sebesar 35-55 nm dalam penambahan GAlCl3/HCl.
  • Flavon dengan 3- atau 3'- atau 5-OH akan menunjukan geseran batokromik pita I 50-60 nm dalam penambahan AlCl3/HCl. Reagent ZrOCl2/asam sitrat dapat digunakan untuk mendeteksi gugus 3-OH dengan adanya 5-OH.
  • Adanya gugus o-diOH pada cincin B dibuktikan dengan adanya geseran batokromik dalam AlCl3 sebesar 30-40 nm dan teramati pada AlCl3/HCl. Kadang ketika AlCl3 segar digunakan dan senyawa mengandung 3',4'-o-diOH geseran pita I sebesar 10 nm kadang teramati diatas yag diperolah untuk AlCl3/HCl. Peningkatan geseran akan terjadi jika terdapat gugus o-diOH pada cincin A sebesar 20-25 nm. Jika gugus o-diOH hadir pada kedua cincin, maka nilai geseran merupakan penjumlahan keduanya.
ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

  • Adanya gugus 5-OH dibuktikan dengan adanya geseran batokromik 10-14 nm pada pita II isoflavon, dan 20-26 nm pada flavanon dan dihidroksiflavonol.
  • Gugus o-diOH hanya akan terdeteksi pada cincin A (6,7 atau 7,8) dimana spektrum akan menunjukan geseran batokromik pita II 11-30 nm pada AlCl3, jauh diatas yang teramati pada AlCl3/HCl.
  • Gugus 3-OH pada dihidroksiflavonol yang tidak memiliki gugus 5-OH bebas memberikan peningkatan geseran batokromik pita II sebesar 30-38 nm dalam AlCl3.
KALKON DAN AURON
  • Adanya gugus 2'-OH pada kalkon dan 4-OH pada auron dibuktikan dengan geseran batokromik pita I 48-64 nm dan 60-70 nm, berturut-turut. Geseran kalkon akan berkurang sekitar 40 nm ketika terdapat oksigenasi pada posisi 3'.
  • Gugus o-diOH pada cincin B akan memberikan peningkatan geseran batokromik40-70 nm pada pita I dalam AlCl3/HCl. Gugus o-diOH pada cincin A akan memberikan peningkatan geseran yang lebih kecil.
ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN
  • Antosianidin dan antosianin yang mengandung gugus o-diOH akan memberikan geseran batokromik 25-35 nm pada PH 2-4 dengan AlCl3. Geseran yang lebih besar teramati pada 3-deoxyanthocyanidin. Efek penambahan gugus o-diOH akan memberikan efek aditif.




Dirangkum dari Buku The Flavonoids. Harborne J.B, T.J Mabry, H. Mabry. Chapman and Hall. London. 1975

Merupakan materi Kuliah pada mata kuliah Elusidasi Struktur
Sekolah Farmasi ITB