Analisis imunokimia adalah analisis berdasarkan reaksi antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab). Analisis ini bisa bersifat kualitatif maupun kuantitatif. Dalam analisis ini senyawa label diperlukan untuk mendapatkan visualisasi hasil reaksi. Prinsip reaksi imulogi pada mamalia adalah sebagai berikut:
Ag + Ab → kompleks Ag-Ab → Reaksi sekunder → Reaksi tersier
(Reaksi primer)
Reaksi sekunder dapat berupa fiksasi komplemen, aglutinasi atau presipitasi, sedangkan reaksi tersier dapat berupa degranulasi atau opsonisasi.
Dalam analisis imunokimia, jika analisis digunakan untuk mendeteksi antigen, maka antigen tersebut sebagai target, dimana antigen berupa senyawa aktif atau racun yang dimaksud. Sedangkan bila analisis dimaksudkan untuk mendeteksi antibodi, maka antigen yang menjadi perekai didalam kit. Antibodi dalam tubuh terbentu berdasarkan antigen yang menginduksinya. Reaksi spesifik antara antigen dan antibodi dapat terjadi melalui ikatan hidrogen, ikatan elektrostatik, ikatan van der walls atau hidofobik.
Senyawa imunogenik adalah senyawa yang dapat memicu sistem imun mamalia. Senyawa antigenik adalah senyawa yang dapat bereaksi spesifik dengan dengan antibodi. Syarat senyawa imunogenik adalah memiliki bobot molekul tinggi, lebih dari 5000 dalton. Bila suatu senyawa memiliki bobot molekul rendah, maka dapat diupayakan melalui konjugasi dengan protein carier agar bersifat imunogenik.
Bahan yang dapat dianalisis secara imunokimia (sebagai antigen) diantaranya:
- Mikroba patogen atau toksin mikroba
- Toksin tanaman atau hewan
- Protein spesifik atau senyawa lain yang berstruktur spesifik
- Senyawa obat (narkotik, psikotropik)
- Senyawa pestisida
Antibodi adalah hasil reaksi humoral sel B dalam limpa mamalia. Antibodi bersifat spesifik terhadap antigen yang memicunya. Contoh antibodi adalah Imunoglobulin; IgA, IgD, IgM, IgE, IgG.
Reaksi antara antigen dan antibodi dengan adanya senyawa label maka hasil reaksi tersebut dapat divisualisasi. Senyawa label adalah senyawa yang dikonjugasikan pada antigen atau antibodi sehingga dapat memvisualisasikan reaksi Ag-Ab yang terjadi. Senyawa label dapat berupa enzim, senyawa yang dapat berflouresensi, radioaktif dan lain-lain. Reaksi amplifikasi dapat dilakukan sehingga dapat diukur secara fisikokimia.
Beberapa contoh senyawa label diantaranya:
- Enzim: Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline phosphatase
Syarat enzim yang ideal sebagai label yaitu:
- memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi rendah
- stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)
- mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi lanjutan atau dalam penyimpanan
- Tersedia dalam keadaan murni (tingkat kemurniannya tinggi)
- harga murah
- Mudah dideteksi dengan cara sederhana
- tidak terdapat dalam cairan sampel biologi yang akan diuji
- Senyawa berflouresensi; fluoresein, umbeliferon, tetrametil rodhamin
- Senyawa luminesence; luciferin
- Partikel: Tanned erythrocyte, colloidal, microsphere, gold, silver
- vesikel: liposom
Karakteristik senyawa label yang diperlukan dalam analisis imunokimia adalah:
- memiliki aktivitas spesifik, aktivitas spesifik label berhubungan dengan: 1). fraksi pada label yang akan digunakan untuk deteksi, 2). derajat amplifikasi, 3). efisiensi deteksi
- mudah dideteksi
- tidak berbahaya
Metode-metode analisis imunokimia berdasarkan label yang digunakan diantaranya:
- EIA (Enzime Immuno Assay)
- ELISA (Enzyme Linked-Immunoabsorbent Assay)
- RIA (Radio Immuno Assay)
- IFA (Immuno Fluoresence Assay)
- LIA (Luminesence Immuno Assay)
Bahan-bahan yang diperlukan dalam analisis imunokimia:
- Antigen
- Antibodi
- Media penyangga reaksi
- Larutan dapar pelarut
- Larutan dapar pencuci
- Senyawa label
- Substrat
- Senyawa penghenti reaksi
- Instrumen pendeteksi hasil reaksi
Langkah-langkah dalam analisis imunokimia:
- Suatu larutan atau suspensi antigen (atau dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam sumur plat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), lalu ditambahkan larutan pemblok untuk menghindari ikatan non-spesifik.
- Larutan antibodi B (antigen A) dimasukkan ke dalam sumur plat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu label (misalnya enzim) ditambahkan sehingga membentuk komplek A-B-C-enzim.
- Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.
- Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi.
Tahapan Radioimmunoassay:
- Sensitize plate
- wash
- add test antibody
- wash
- add radiolabelled ligand
- wash
- count
Tahapan ELISA:
- Sensitize plate
- wash
- add test antibody
- wash
- add ligand
- wash
- add chromogen
- develop plate
Sumber kesalahan dalam analisis imunokimia:
- Kesalahan random/acak (impresisi)
Kesalahan acak dapat berupa:
2. Kesalahan sistemik (inakurasi)
- pemipetan; masalah desain pipet itu sendiri, cara menggunakan dan hal teknis dalam penggunaan pipet (volume yang dikeluarkan)
- Pemisahan padatan dari cairan; proses pembentukan endapan yang tergantung waktu, kecepatan, suhu, dll, proses pencucian yang tidak sempurna
- Kondisi reaksi biokimia; konstanta kesetimbangan antibodi, waktu, suhu
- Jumlah radioaktif, jika menggunakan RIA
- Intensitas fluoresensi yang terjadi jika menggunakan IFA
- Kesalahan spektrofotometrik
- Stabilitas pereaksi
- Masalah kalibrasi alat, bentuk pipet
- Interferensi dalam reaksi; terjadinya pengikatan nonspesifik, inhibisi enzim, pendaran cahaya, adanya pengaruh enzim endogen, pengaruh obat lain yang digunakan, pengaruh senyawa endogen lainnya (bilirubin, dll)
- Efek matriks
Seluruh MATERI dalam tulisan ini adalah materi yang disampaikan
Ibu MARLIA SINGGIH WIBOWO
dalam Kuliah Mikrobiologi Obat dan Makanan
SEKOLAH FARMASI ITB
